Флуоресцентный инвертированный микроскоп: устройство и работа с живыми клетками

Флуоресцентные метки показывают, где в клетке находится белок, жива ли она и делится ли. Чтобы увидеть это на культуре, которая растёт на дне чашки под слоем среды, объектив должен подходить к клеткам снизу. Поэтому для работы с живыми культурами флуоресцентный модуль ставят на инвертированный штатив.

Такой прибор сочетает две схемы сразу, и у каждой свои требования к посуде, объективам и свету. Ниже описано, как он устроен и что нужно учесть, чтобы клетки дожили до конца эксперимента, а сигнал не утонул в фоне.

Как устроен прибор

У инвертированного микроскопа объективы расположены под столом и смотрят вверх, а осветитель проходящего света с конденсором находится над столом. Флуоресцентный осветитель подключён сзади или сбоку. Его свет проходит через блок фильтров, отражается вверх и попадает на препарат через тот же объектив, который собирает ответное свечение. Такую схему называют эпифлуоресцентной.

Проходящий свет при этом не теряет значения. В фазовом контрасте исследователь находит клетки и оценивает их форму, а затем переключается на флуоресценцию и смотрит метку в том же поле зрения. Наложение двух снимков показывает, каким клеткам принадлежит сигнал.

Блоки фильтров

Каждый флуоресцентный краситель поглощает свет в одном диапазоне длин волн и испускает в другом, более длинноволновом. Блок фильтров, или куб, состоит из трёх элементов. Возбуждающий фильтр пропускает из спектра лампы только нужную полосу. Дихроичное зеркало отражает её к препарату и пропускает более длинноволновое свечение обратно. Запирающий фильтр отсекает остатки возбуждающего света перед окулярами и камерой.

Кубы устанавливают в турель на несколько позиций. Типичный набор включает куб для синих ядерных красителей, для зелёных белков и меток и для красных. Подбирают их по спектрам конкретных флуорофоров, которые использует лаборатория. Ошибка в подборе выглядит как слабый сигнал или как просачивание одного канала в другой.

Источник света: лампа или светодиоды

Долгое время стандартом были ртутные дуговые лампы. Они дают яркие линии в ультрафиолетовой, синей и зелёной областях, но служат несколько сотен часов, требуют прогрева и юстировки, а их утилизация регламентирована из-за ртути. Металлогалогенные источники с жидким световодом работают дольше и светят равномернее.

Светодиодные осветители постепенно вытесняют оба варианта. Они включаются мгновенно, не нагревают препарат, служат десятки тысяч часов и позволяют управлять яркостью каждого канала отдельно. Для живых клеток это особенно важно: свет подаётся только на время экспозиции кадра, и клетки получают меньшую дозу.

Объективы и толщина дна посуды

Объективу приходится смотреть сквозь дно чашки или планшета. У стандартного культурального пластика оно около миллиметра толщиной, и обычный объектив, рассчитанный на покровное стекло 0,17 мм, даёт через него размытое изображение. Поэтому на инвертированные штативы ставят объективы с увеличенным рабочим расстоянием и коррекцией на толстое дно. У многих из них есть кольцо, которым поправку подстраивают под конкретную посуду.

Для флуоресценции важна числовая апертура: от неё зависит и разрешение, и количество собранного света. Объективы с большой апертурой имеют короткое рабочее расстояние и требуют тонкого дна. Отсюда практическое правило: обзор и подсчёт клеток ведут на пластике с объективами 10х и 20х, а детальную съёмку внутриклеточных структур выполняют в посуде со стеклянным дном толщиной с покровное стекло.

Фон: пластик, среда и рассеянный свет

Слабый сигнал легко теряется на светящемся фоне. Источников фона несколько. Полистирол культуральной посуды сам флуоресцирует, особенно при ультрафиолетовом и синем возбуждении. Питательная среда с феноловым красным и сывороткой тоже светится. На время съёмки её заменяют бесцветной средой или буферным раствором.

Свечение приходит и от клеток, лежащих выше и ниже плоскости резкости. В тонком монослое это не мешает, а в толстых образцах и сфероидах изображение становится туманным. Здесь помогают программная деконволюция или переход к конфокальной съёмке.

Как не повредить живые клетки

Возбуждающий свет вреден для клеток. Под его действием флуорофоры разрушаются, а побочные продукты этих реакций повреждают клеточные структуры. Клетки перестают делиться, округляются, открепляются от подложки. Чтобы этого избежать, придерживаются нескольких правил.

• Наводить резкость и искать поле зрения в проходящем свете, а флуоресценцию включать только для кадра.
• Снижать интенсивность возбуждения и увеличивать чувствительность камеры, а не наоборот.
• Предпочитать длинноволновые красители, когда методика это допускает: красный свет повреждает клетки слабее ультрафиолета.
• Закрывать затвор между кадрами в длительных сериях.

Для экспериментов, которые длятся часами, на стол ставят инкубационную камеру с подогревом, подачей углекислого газа и увлажнением. Без неё среда защелачивается и остывает, и поведение клеток перестаёт отражать нормальные условия.

Камера и комплектация

Флуоресцентный сигнал обычно слабый, поэтому для съёмки берут монохромные охлаждаемые камеры с высокой чувствительностью. Цветное изображение собирают программно из отдельных каналов. Цветная камера удобна для документирования окрашенных препаратов в проходящем свете, но на слабой флуоресценции проигрывает монохромной.

Комплектацию выбирают от задач. Для контроля трансфекции достаточно штатива с двумя или тремя кубами и объективами до 40х. Для покадровой съёмки добавляют моторизованный стол, затворы и камеру инкубации. В компании Арстек можно подобрать флуоресцентный инвертированный микроскоп под используемые красители и посуду, среди оборудования брендов Olympus, Leica, Nikon и Zeiss.

Где такой прибор применяют

Основная область связана с клеточной биологией: оценка эффективности трансфекции по свечению репортерного белка, тесты на жизнеспособность с парой красителей для живых и мёртвых клеток, наблюдение за делением и миграцией. В фармакологии на таких приборах оценивают действие соединений на культуры в многолуночных планшетах.

В микробиологии и вирусологии инвертированная схема удобна для просмотра заражённых культур прямо во флаконах. В работах с органоидами и тканевыми моделями прибор служит для первичной оценки, после которой образцы передают на конфокальную съёмку.